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目的 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建抗肌萎縮蛋白 (dystrophin，Dmd) 基因第23號外顯子點突變 的Dmd基因突變小鼠，分析并驗證該小鼠在肌肉及免疫系統中的表型變化，為杜氏肌營養不良癥等疾病提供評價 模型。>>>商務洽談，點此處，在線咨詢

方法 針對Dmd基因23號外顯子序列特征，設計合成小向導RNA (small guide RNA，sgRNA);將Cas9 mRNA、sgRNA片段和oligo donor DNA顯微注射到C57BL/6J小鼠受精卵中，并將該受精卵移植至代孕鼠后出生 獲得 F0 代小鼠;F0 代小鼠通過交配獲得子代小鼠后，基因型鑒定篩選得到 Dmd 基因陽性突變小鼠 (命名為 DmdMu/+小鼠)。選擇 3 月齡和 9 月齡的雄性半合子 DmdMu/+小鼠 (命名為 DmdMu/Y小鼠) 和野生型 C57BL/6J 小鼠 (作為對照) 用于表型驗證：稱量記錄活體小鼠體重，并通過懸掛實驗檢測小鼠肌張力;采集心臟和半腱肌，采用 HE染色法觀察組織病理學變化，進一步通過蛋白質印跡法檢測9月齡小鼠肌肉組織內Dmd蛋白的表達情況。利用 脂多糖誘導建立DmdMu/Y小鼠急性炎癥模型，采集小鼠頜下靜脈血，采用流式細胞術檢測外周血中性粒細胞和單核 細胞比例變化。

結果 基因組測序和蛋白質印跡結果表明 Dmd 基因點突變小鼠 (即 DmdMu/+小鼠) 構建成功， DmdMu/+小鼠骨骼肌和心肌中未見Dmd蛋白表達，與野生型C57BL/6J小鼠相比明顯下降 (P<0.05)。與背景相同的 野生型小鼠相比較，3月齡和9月齡的雄性半合子突變小鼠 (DmdMu/Y小鼠) 體重明顯減輕 (P<0.01)，肌張力顯著 下降 (P<0.05);9月齡DmdMu/Y小鼠的骨骼肌和心肌發生肌間隙變寬等明顯病變。未注射脂多糖時，與野生型小鼠 相比，3 月齡 DmdMu/Y小鼠的外周血中性粒細胞和單核細胞比例顯著降低 (P<0.01);經脂多糖誘導后，3 月齡 DmdMu/Y小鼠的外周血中性粒細胞比例仍然較野生型小鼠顯著降低 (P<0.01)，而9月齡DmdMu/Y小鼠的外周血中性 粒細胞比例在脂多糖誘導后顯著升高 (P<0.05)，但較野生型小鼠仍顯著降低 (P<0.01);同月齡DmdMu/Y小鼠經脂 多糖誘導后外周血單核細胞比例與野生型小鼠相比僅有偏低趨勢 (P>0.05)。

結論 成功構建了Dmd基因突變小鼠 模型，證實該基因具有維系肌肉組織正常形態和肌張力等重要功能，并初步發現該基因缺失會減少外周血液中性粒 細胞比例，為后續研究杜氏肌營養不良癥患者的免疫系統異變機制提供新的思路。

閱讀原文：Dmd基因突變小鼠構建及在肌肉及免疫系統的表型驗證.pdf

來源：實驗動物與比較醫學2024年第1期

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