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弗吉尼亞大學(xué)發(fā)現(xiàn)全新Myh11-CreERT2-RAD小鼠可作為平滑肌細(xì)胞研究的新工具

新聞來源：CEIDI西遞發(fā)布時間：2024-03-19

平滑肌細(xì)胞(SMC, Smooth Muscle Cell)組成了血管和內(nèi)臟器官的肌肉層，在損傷、炎癥或高膽固醇血癥的情況下，血管SMC可以“去分化”和增殖，若不加以控制，會導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生、動脈粥樣硬化及其他病變。由于去分化的SMC會嚴(yán)重下調(diào)特異性收縮蛋白的表達(dá)，因此在譜系追蹤方法出現(xiàn)之前，SMC在心血管疾病中的作用一直被低估。人們利用Cre-loxP重組系統(tǒng)對成熟的SMC進(jìn)行標(biāo)記后，發(fā)現(xiàn)分化的SMC可產(chǎn)生多種細(xì)胞，類似巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。這些結(jié)果從根本上改變了SMC的研究。>>>商務(wù)洽談，點此處，在線咨詢

Myh11-CreERT2-Off小鼠品系被認(rèn)為是SMC研究中的金標(biāo)準(zhǔn)，目前已廣泛用于條件突變或譜系追蹤實驗。這個品系在血管和內(nèi)臟SMC中發(fā)生特異性重組，表明編碼平滑肌肌球蛋白重鏈的MYH11仍是分化SMC的最具特異性標(biāo)志物。不過，遺憾的是，這種基于細(xì)菌人工染色體(BAC, bacterial artificial chromosome)的小鼠品系插入位置位于Y染色體中，因此無法對雌性小鼠進(jìn)行分析。為此，弗吉尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院等機(jī)構(gòu)的研究人員構(gòu)建了一種新的小鼠品系Myh11-CreERT2-RAD。他們在小鼠的2號染色體上插入BAC，因此可以在雄性和雌性小鼠上開展譜系追蹤和基因敲除研究。這項成果發(fā)表在《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》雜志上。

弗吉尼亞大學(xué)發(fā)現(xiàn)全新Myh11-CreERT2-RAD小鼠可作為平滑肌細(xì)胞研究的新工具

圖片來源：《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》

(https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/ATVBAHA.122.318160)

研究材料與方法

在這項研究中，研究人員對BAC克隆RP23-151J22進(jìn)行改造，在Myh11基因的起始密碼子后插入Cre-ERT2表達(dá)框，產(chǎn)生了Myh11-CreERT2-RAD轉(zhuǎn)基因小鼠品系(由賽業(yè)生物提供)。他們將Myh11-CreERT2-RAD小鼠與兩種不同的熒光報告基因小鼠雜交，并通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光分析檢測了SMC的特異性標(biāo)記。

技術(shù)路線

01 對細(xì)菌人工染色體進(jìn)行改造，構(gòu)建Myh11-CreERT2-RAD小鼠

02 通過報告基因表達(dá)比較Myh11-CreERT2-RAD與Myh11-CreERT2-Off的活性

03 評估Myh11-CreERT2-RAD轉(zhuǎn)基因驅(qū)動的Cre表達(dá)是否具有SMC特異性

04 評估Myh11-CreERT2-RAD小鼠在缺乏tamoxifen下的報告基因表達(dá)

研究結(jié)果

1 構(gòu)建Myh11-CreERT2-RAD小鼠

研究人員首先對BAC克隆進(jìn)行改造，在小鼠Myh11基因的起始密碼子后插入Cre-ERT2表達(dá)框，并去除BAC載體骨架上的loxP和loxP511位點。之后將改造后的BAC注射到C57BL/6小鼠受精卵的原核中，使其隨機(jī)插入基因組。然后將受精卵植入代孕母親體內(nèi)，獲得攜帶轉(zhuǎn)基因的后代。Myh11-CreERT2-RAD小鼠的構(gòu)建工作由賽業(yè)生物完成。為了確定Myh11-CreERT2-RAD轉(zhuǎn)基因的染色體插入位點，他們進(jìn)行了靶向位點擴(kuò)增分析和新一代測序，顯示轉(zhuǎn)基因整合在2號染色體上。

2 與Myh11-CreERT2-Off小鼠的比較

為了比較Myh11-CreERT2-RAD與Myh11-CreERT2-Off的活性，研究人員將小鼠與tdTom或eYFP熒光報告基因小鼠雜交，并在小鼠口服tamoxifen后通過共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)評估熒光蛋白表達(dá)(圖1)。他們發(fā)現(xiàn)，口服tamoxifen可以誘導(dǎo)Cre+小鼠頭臂動脈的SMC表達(dá)tdTom或eYFP。細(xì)胞計數(shù)顯示，頭臂動脈中95%的SMC表達(dá)tdTom。

通過熒光蛋白分析，研究人員發(fā)現(xiàn)Myh11-CreERT2-RAD和Myh11-CreERT2-Off小鼠的報告基因表達(dá)差異小于10%。重要的是，管腔內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞或外彈力板的外膜細(xì)胞沒有檢測到標(biāo)志物。按性別來看，雄性和雌性Myh11-CreERT2-RAD小鼠的報告基因表達(dá)無顯著差異。這些結(jié)果表明，Myh11-CreERT2-RAD轉(zhuǎn)基因驅(qū)動了動脈中SMC的報告基因重組，并且與雄性Myh11-CreERT2-Off小鼠相當(dāng)。

Myh11-CreERT2-RAD有效誘導(dǎo)了floxed tdTom報告基因重組[1]

3 熒光蛋白表達(dá)具有SMC特異性

為了確定Myh11-CreERT2-RAD轉(zhuǎn)基因驅(qū)動的Cre表達(dá)是否具有SMC特異性，研究人員通過免疫熒光共聚焦顯微鏡檢查了各種組織中的tdTom表達(dá)。他們在心臟的冠狀血管中觀察到tdTom表達(dá)，并在肺動脈和肺周細(xì)胞以及視網(wǎng)膜和斜方肌的小血管和周細(xì)胞中檢測到tdTom表達(dá)。通過這些數(shù)據(jù)，他們認(rèn)為Myh11-CreERT2-RAD轉(zhuǎn)基因在血管和內(nèi)臟SMC及周細(xì)胞中驅(qū)動Cre重組的方式與Myh11-CreERT2-Off類似。

4 轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出不依賴tamoxifen的報告基因重組

之前有報道稱，許多CreERT2小鼠品系表現(xiàn)出不依賴tamoxifen的重組。為了確定Myh11-CreERT2-RAD或Myh11-CreERT2-Off小鼠是否會出現(xiàn)這種情況，研究人員檢測了未口服tamoxifen的轉(zhuǎn)基因小鼠中的tdTom或eYFP表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)，在缺乏tamoxifen的情況下，兩種轉(zhuǎn)基因小鼠均零星表達(dá)了tdTom，但eYFP表達(dá)未檢測到(圖2)。

他們推測，tdTom報告基因的重組閾值較低，因此與包括eYFP在內(nèi)的其他報告基因相比，特別容易受到CreERT2本底重組的影響。后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，這種重組是SMC特異性的，只有在Myh11-CreERT2-RAD或Myh11-CreERT2-Off轉(zhuǎn)基因存在時才會發(fā)生，原因可能是一部分的CreERT2蛋白在沒有tamoxifen的情況下被轉(zhuǎn)運到了細(xì)胞核。這種滲漏取決于floxed基因的重組閾值，需要對每個基因進(jìn)行嚴(yán)格評估。

Myh11-CreERT2-RAD和Myh11-CreERT2-Off可誘導(dǎo)不依賴tamoxifen的報告基因重組[1]

研究結(jié)論

總的來說，這項研究構(gòu)建并驗證了一種新的常染色體Myh11 Cre驅(qū)動的小鼠Myh11-CreERT2-RAD。它的性能與Myh11-CreERT2-Off小鼠類似，但優(yōu)點是可以同時研究雄性和雌性小鼠。這種小鼠品系是一種有價值的新工具，有助于發(fā)現(xiàn)健康和疾病狀態(tài)下SMC功能的性別差異。

原文檢索：[1]Deaton RA, Bulut G, Serbulea V, et al. A New Autosomal Myh11-CreERT2 Smooth Muscle Cell Lineage Tracing and Gene Knockout Mouse Model-Brief Report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023 Feb;43(2):203-211. doi: 10.1161/ATVBAHA.122.318160.

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